Schnelle Methodenentwicklung in der RP-HPLC

Der HPLC-Tipp 05/2007 von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Sie müssen eine Methode schnell entwickeln und Sie haben wenig Zeit. Selbstverständlich verfügen Sie über eine moderne Gradientenanlage und über ein ansehnliches Säulen-Portfolio. Was wäre nun eine sinnvolle, ökonomische Vorgehensweise, um die Methode wenigstens grob entwickeln zu können?

Die Lösung

Hardware-Voraussetzung: Sollten Sie über eine Niederdruck-Gradientenanlage mit PDA verfügen, benötigen Sie lediglich ein 6-Säulenschaltventil, im Falle eines Hochdruck-Gradienten zusätzlich ein Eluentenschaltventil.

Das Konzept

Bekanntlich hängt die Selektivität von der stationären Phase, von dem Eluenten (inkl. Gradient) und von der Temperatur ab, wobei zunächst die zwei Erstgenannten in Frage kommen. Stationäre Phase bedeutet „Chemie” der Oberfläche (also, polarer/hydrophober Charakter der funktionellen Gruppe(n)), und beim Eluenten ist im Wesentlichen die Zusammensetzung sowie der pH-Wert gemeint. Es geht also bei einer effektiven Methodenentwicklung um das schnelle Testen relevanter Kombinationen.

Die Realisierung

Vorbemerkung:
Wir gehen hier von Worst Case aus, d.h. von fast keinerlei Informationen über die Probe. In der Realität sieht es häufig positiver aus, das bedeutet, man kann etwas gezielter vorgehen.

Die drei Schritte:

1. Säulen-Vorauswahl

Das 6-Säulenschaltventil wird mit 6 unterschiedlichen Säulen bestückt: Zwei hydrophobe (z. B. LUNA, XBridge C18, YMC Pro C18 RS, Nucleodur C18, Ascentis C18 usw.), zwei mittelpolare (z. B. Synergi FUSION, Polaris, Atlantis d C18, Nucleodur Sphinx, Acclaim C18 usw.) und zwei recht polare (z. B. Synergi POLAR RP, Gemini Hexyl Phenyl, XBridge Shield, Ascentis Amide C16, Platinum EPS oder aber eine klassische CN- oder Diolphase). Die Länge der Säulen sollte – wenn es keinen driftigen Grund gibt – 10 cm nicht überschreiten, wobei ich persönlich für die ersten Versuche noch kürzere verwenden würde.

2. Variation von Gradient und Lösungsmittel (vernünftigerweise über Nacht)

Zunächst werden die Polarität und das organische Lösungsmittel variiert. Die Elutionskraft (via Gradient) und die Natur des organischen Lösungsmittels sind interessante Parameter bzgl. Selektivität im Falle von neutralen und mittelpolaren Analyten. Dazu werden die vier Eingänge der Niederdruckpumpe bzw. das Eluentenschaltventil mit ACN, Methanol, THF, Wasser angeschlossen und es werden folgende vier Gradienten über Nacht über die 6 Säulen gefahren:
A: 10% auf 90% ACN, linearer Gradient, 2ml/min, 15 min
B: Wie unter A, 50% jedoch des organischen Anteils werden gegen Methanol ersetzt
C: Wie unter A, 20% jedoch des organischen Anteils werden gegen THF ersetzt

3. Variation des pH-Wertes (vernünftigerweise über Nacht)

Man verwende dazu die „beste” Kombination aus Test 1 und variiere jetzt den pH-Wert. Die zu verwendete Säure/Base ist entsprechend den Erfahrungen im Labor auszusuchen (z. B. TFA, Perchlorsäure, Perfluorbuttersäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Ameisensäure, bzw. Ammoniak, Triethyl-/Octylamin, Natronlauge) oder aber man verwendet gleich den entsprechenden (schwachen) Puffer.
A: pH = 2-3
B: pH = 4-5
C: pH = 7-8
D: Spüllösung
Bemerkung:
Wird erwartet, dass eine gute Selektivität sich evtl. im Alkalischen ergibt (Trennung starker Basen), ist diesem Sachverhalt natürlich Rechnung zu tragen:
A: pH = 9
B: pH = 10
C: pH = 11
D: Spüllösung
Für diesen Fall in Frage kommenden Säulen wären z. B. Gemini (C18, Phenyl, Phenyl Hexyl), XBridge (C18, Shield, Phenyl) evtl. PRP 1, pHILIC, Pathfinder.

Selbstverständlich existieren jede Menge Varianten, es sei hier nur eine erwähnt: In der ersten Nacht werden die Gradienten mit den unterschiedlichen Lösungsmittel im Sauren gefahren und der Gradient mit dem „besten” Lösungsmittel wird in der zweiten Nacht bei verschiedenen pH-Werten getestet. Damit hätte man quasi „über Nacht” (genauer: nach zwei Nächten) überprüfen können, welche Lösungsmittel/Säule- bzw. pH-Wert/Säule- bzw. Lösungsmittel/pH-Wert/Säule-Kombination die meisten Peaks liefert. Die „beste” Kombination wird nun bei zwei Temperaturen (15 °C und 40 °C) getestet. Je nach vorherrschendem Mechanismus (hydrophobe, polare, ionische Wechselwirkungen, Komplexbildung, Wasserstoffionenbrückenbindung usw.) ist die Auflösung bei niedriger oder höherer Temperatur besser. Der Wechsel von z. B. 30 °C auf lediglich 40 °C oder umgekehrt bedeutet eine zu geringe Variation. Jetzt steht einer Feinoptimierung (Gradient, Säulenlänge usw.) und ersten Peakhomogenitäts- und Robustheitstests nichts mehr im Wege.

Das Fazit

Mit einer gewissen Systematik zur Prüfung relevanter Selektivitätsparameter und mit Hilfe üblicher Hardware ist es realistisch, innerhalb zweier Nächte und einem bis zwei Tage eine Methode grob zu entwickeln. Natürlich sind weitere verwandte Strategien denkbar (s. dazu Details in (1)). Es geht letzten Endes erstens darum, die Fleißarbeit nachts und die Geistarbeit ( d.h. Entscheidungen fällen) tagsüber zu erledigen und zweitens stets das Prinzip der Ökonomie im Kopf zu behalten.

(1) Stavros Kromidas (Hrsg.) „HPLC richtig optimiert”, WILEY-VCH, ISBN 3-527-31470-9,1996