Die „Kleinen”

Der HPLC-Tipp 07/2007 von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Alternativen zu Phosphor- und Trifluoressigsäure

Bekanntlich werden für den stark sauren Bereich (pH-Wert um 2-2,5) gerne H₃PO₄ oder TFA verwendet. Der pH-Wert wird häufig nicht eingestellt, auch auf die Verwendung von Puffern wird verzichtet: Eine mögliche kleine Verschiebung des pH-Wertes ist in diesem recht sauren Bereich nicht tragisch, eine merkliche Verschiebung der Retentionszeit wird selten beobachtet. Nun zeigt sich immer wieder, dass nicht nur der pH-Wert – sicherlich der wichtigste Faktor! – sondern auch die verwendete Säure die Selektivität beeinflussen kann. Man sollte bei Optimierungsversuchen im Sauren beispielsweise neben den üblich verwendeten Säuren Phosphor-, Trifluoressig-, Essig-, und Ameisensäure auch an Perchlor-, Perfluorbutter-, Butter-, Propion- oder Schwefelsäure denken. Mit Hilfe eines Eluentenschaltventils kann deren Einfluß auf die Selektivität über Nacht problemlos geklärt werden.

Für welche Substanzen eignet sich eine hohe Flussrate besonders gut?

Wir haben uns an dieser Stelle des öffteren darüber unterhalten, dass ein Fluss von 1,5-2 ml/min gegenüber dem üblichen Wert von 1 ml/min selten nennenswerte Nachteile mit sich bringt. Dies sollte man besonders bei kleinen Molekülen bedenken: Je kleiner die Moleküle (Molekulargewicht unter ca. 150 Dalton), umso größer der Diffusionskoeffizient, umso kleiner der Massentransportterm in der Van-Deemter- Gleichung, umso höher kann eine höhere Flussrate ohne Verlust an Effizienz verwendet werden.

Welche Analyte bleiben an welche Oberflächen „hängen”?

Die Gefahr von irreversibler Adsorption bestimmter Analyte an „hungrige” Oberfläche ist vielen Lesern sicherlich geläufig. Dazu folgendes: Organische, hydrophobe Analyte bleiben an Polyethylen, starke Basen an Glas (denke an die SiO₂-Gruppen - genauso wie beim Kieselgel!) „hängen”. Vermeiden Sie den Kontakt solcher Proben mit diesen Materialien. Sicherlich, man kann mit einigen Tricks versuchen, die Oberfläche inert zu machen – aber sicher ist sicher, lassen Sie solche Spielchen im Falle von quantitativen Bestimmungen im Spurenbereich lieber sein.

Gleiches Gradientenprofil bei Änderung der Säulenlänge (Tipp Uwe Neue, Waters Milford)

Sagen wir, Sie sind dabei eine Gradientenmethode zu entwickeln und haben eine brauchbare aber noch nicht optimale Säulen-Gradient-Kombination gefunden. D. h. Sie sind eigentlich mit der Selektivität der Säule zufrieden aber die Auflösung ist noch nicht ausreichend, deswegen möchten Sie eine längere Säule mit dem gleichen Phasenmaterial verwenden. Vernünftigerweise möchten Sie das Gradientenprofil Ihres mühsam entwickelten Gradienten übernehmen. Wie kann man es ausrechnen? Wichtig ist dabei, dass das Gradientenvolumen dem neuen Säulenvolumen angepasst wird. Vorausgesetzt nun, dass der Innendurchmesser der Säulen konstant bleibt, muss das Gradientenvolumen um das Längenverhältnis der zwei Säulen multipliziert werden.
Beispiel:
Ursprüngliche Säule: 12,5 cm, neue Säule 25 cm. Entweder man lässt den Fluß konstant und multipliziert die Zeiten in der Gradiententabelle mit 25/12,5 = 2 oder man lässt die Gradientendauer konstant und multipliziert den Fluß mit Faktor 2 – ein vernünftigerer Weg, um Zeit zu sparen (wenn natürlich der Druck „mitmacht”). Dieses Prinzip gilt auch, wenn man beispielsweise um Nachweisgrenze zu gewinnen den Innendurchmesser verringern möchte.
Beispiel:
Ursprüngliche Säule: 12,5 cm x 4,6 mm, neue Säule 12,5 cm x 3 mm. Das Gradientenvolumen soll um Faktor 4,6²/3² = 21,16/9 = 2,35 reduziert werden, wiederum entweder über die Retentionszeit oder über den Fluß