Unterschiedliche Peakflächen beim Methodentransfer, Teil 2

Der HPLC-Tipp 02/2008 von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Im Februar-Tipp haben wir uns mit physikalisch/chemischen Ursachen beschäftigt, die beim Methodentransfer zu unterschiedlichen Flächen (und somit zu unterschiedlichen Gehalten) führen - trotz technisch einwandfreier Hardware. Heute geht es um Probleme bei der Anwendung der Methode, einmal durch unterschiedliche Zahlenwerte innerhalb der Spezifikationsanforderungen und einmal durch Unterschiede bei den Einstellparametern, sowohl was die Datenaufnahme als auch die Integration betrifft.

1. Spezifikationsanforderungen

Betrachten wir als Beispiel folgende Anforderungen in einer Prüfvorschrift: „pH-Wert des Eluenten 4,5 +/- 0,1 pH-Einheiten, Tailingfaktor des Hauptpeaks kleiner/gleich 1,3, Auflösung R zwischen Hauptpeak und Verunreinigung größer/gleich 1,5”.
Im Extremfall – aber immer noch innerhalb der Vorgaben und somit „ok”! – weist der pH-Wert des Eluenten in dem einen Labor 4,6 und in dem anderen 4,4 auf, der Tailingfaktor beträgt einmal 1,1 und einmal 1,3 das eine Labor erreicht schließlich eine Auflösung von 1,5 das andere jedoch 2,0. Diese Unterschiede resultieren beispielsweise durch Differenzen in der Packungsqualität der eingesetzten Säulen, durch eine geringfügige Differenz in der Geometrie der Mischkammer, durch eine nicht exakt kalibrierte pH-Elektrode usw. Daraus ergeben sich womöglich Unterschiede in der Peakform bzw. im Peak/Rauschen-Verhältnis. Und dies wiederum führt zu Unterschieden in der Peakfläche, da die Integration durch Peakform bzw. Auflösung stark beeinflußt wird. So kann der Inegrationsfehler bei einer Auflösung von 1,5 wesentlich größer sein – vor allem bei tailenden Peaks und/oder bei unterschiedlich großen Peaks – als bei einer Auflösung von 1,8 oder 2,0, s. dazu den Januar-Tipp.

2. Einstellparameter

Wir haben in einer Reihe von Tests festgestellt, dass Einstellparameter wie Datenrateaufnahme (Sample Rate), Zeitkonstante (Time Constant), Band- (Bandwidth) bzw. Peakbreite (Peakwidth) sowie Threshold die Integration dramatisch beeinflussen können. Im Falle von kleinen Peaks (Verunreinigungen, Spuren- bzw. Nebenkomponentenanalytik) reichen sogar Unterschiede in der dritten Stelle nach dem Koma bei Threshold bzw. in der zweiten Stelle nach dem Koma bei Zeitkonstante und Peakbreite, so dass kleine Peaks nicht erkannt werden und/oder sich Integrationsfehler von 100% ergeben! Auch die von vielen Herstellern empfohlene Sample Rate von 15 oder 20 Datenpunkte ist für schnelle, schmale Peaks definitiv zu gering. Ergebnis sind große Integrationsfehler bei frühen, nicht-aufgelösten Peaks. Wenn nun – um zu unserer Problematik beim Methodentransfer zurück zu kommen – bei den zwei Labors die Einstellparameter andere Zahlenwerte aufweisen, sind absolute Differenzen in den Flächenwerten unausweichlich oder zumindest recht wahrscheinlich.
Wenn noch die sehr individuell gehandhabte manuelle Integration als „Ausweg” zum Erreichen von Spezifikationsanforderungen als weitere Variable hinzu kommt, wundert man sich, dass zwischen Labors Ergebnisse im Falle von schwierigen Trennungen überhaupt vergleichbar sind...

Mit dem Ziel, Vergleichbarkeit von Ergebnissen beim Methodentransfer von HPLC-Methoden zu ermöglichen, scheinen konkrete Absprachen zum Procedere bzgl. Datenaufnahme und Inegration für den Fall von chromatographisch „schwierigen” Situationen unerlässig. Chromatographisch „schwierige” Situation bedeutet vor allem schlecht aufgelöste Peaks, driftende Basislinie oder „Buckel” sowie Peaks in der Nähe der Bestimmungsgrenze. Ferner ist nur sinnvoll, wenn in einer Prüfvorschrift genaue Angaben über Aufnahme- und Inegrationparameter enthalten sind oder zumindest Empfehlungen für die konkrete Applikation ausgesprochen werden. Dadurch wird verhindert, dass die Default-Werte unreflektiert verwendet werden und die Notwendigkeit der manuellen Integration auf ein Minimum reduziert wird. Letztere führt zwar häufig zu „richtigeren” Ergebnissen, dabei wird jedoch aufgrund der starken Individualität die Vergleichbarkeit der Ergebnisse erschwert.