Nimm Dir die Zeit und lasse Chromatogramme „sprechen”...

Der HPLC-Tipp 04/2008 von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Die Chromatogramme „erzählen” viel – man sollte sich nur die Zeit nehmen, sie etwas bewusst anzuschauen. Das sei nachfolgend anhand der Chromatogramme der Abbildung 1 demonstriert. Dieses Beispiel stammt von der Arbeitsgruppe Prof. Engelhardt, Saarbrücken. Das obere Chromatogramm wurde mit einer neuen Säule aufgenommen, das zweite nachdem die Säule 1 Jahr lang in Methanol/Wasser gelagert wurde. Was fällt auf und wie können wir die Unterschiede erklären?

Abb. 1 Die zwei Chromatogramme wurden mit einem Abstand von ca. 1 Jahr bei identischen chromatographischen Bedingungen aufgenommen, die Säule war in dieser Zeit in Methanol/Wasser gelagert

Es fallen direkt zwei Sachen auf:

Die Elutionsreihenfolge hat sich geändert (s. Peak Nr. 7 und 9), wobei einige Peaks etwas später (Nr. 2,4,5,6 und 7), einige etwas früher eluieren (Nr. 10,8 und 9).
Die nach vorne gewanderte Peaks sehen - was die Peaksymmetrie betrifft - auch nach einem Jahr gut aus (Nr. 10,8 und 9), die später eluierende wiederum sind breiter geworden bzw. haben ein Tailing bekommen (Nr. 2,4,5,6 und 7).

Wenn man nun einen Blick auf die chromatographierten Substanzen wirft und deren Charakter im Zusammenhang mit deren Retentionszeitverschiebung bzw. deren Peakform sieht, gelangt man zu folgenden Feststellungen:

Eine gute Peaksymmetrie auch nach 1 Jahr zeigen „unproblematische” Substanzen: neutrale Aromaten (Toluol, Ethylbenzol, Bezoesäureethylester), eine schwache Säure (Phenol) und eine inerte Komponente (Thioharnstoff)
Peakverbreiterung bzw. Tailing verbunden mit einer Zunahme der Retentionszeit – was zur Elutionsumkehr von Peak 7 und 9 führt - weisen basische Substanzen auf: Anilin, o-m-p-Toluidin, NN-Dimethylanilin.

Was ist passiert?
Möglicherweise sind ein Teil der C₈-Alkylketten hydrolysiert („Bluten” der Säule), es entstehen zusätzliche Silanolgruppen, die stationäre Phase ist dadurch etwas polarer geworden. Die neutralen, hydrophoben Aromaten, die spät eluieren, gehen nun mit der polarer gewordenen stationären Phase schwächere Wechselwirkungen ein, die Retentionszeit nimmt etwas ab. Die basische Substanzen dagegen „freuen” sich, dass jetzt zusätzliche polare Gruppen entstanden sind und bleiben gerne dort hängen. Ergebnis: Verschiebung der Retentionszeit nach hinten sowie Tailing aufgrund der langsamen Kinetik bei der Desorption der Basen von den Silanolgruppen. Es handelt sich hier also um chemisches Tailing; Hätte dagegen die Packungsqualität nachgelassen, bekämen wir bei allen Peaks eine schlechte Peakform. Die hier vermutlich stattgefundene Hydrolyse der relativ kurzen C₈- Alkylketten wird in einem relativ polaren Milieu (Lagerung hier in Methanol/Wasser) begünstigt.

Fazit

Man kann leicht und schnell zwischen einer Verschlechterung der Packungsqualität ( stoffunspezifische Ursache für Tailing/Verschlechterung der Peakform) und einer chemischen Veränderung der Oberfläche (stoffspezifische Ursache für Tailing/Verschlechterung der Peakform) unterscheiden: Wenn die Packungsqualität nachlässt, haben wir eine Verschlechterung der Peakform bei allen Peaks – unabhängig davon, ob sie neutral oder polar/ionisch sind. Das ist hier nicht der Fall, die Säule ist bzgl. Packungsqualität nach 1 Jahr immer noch einwandfrei. Für die Peakverbreiterung/das Tailing bei bestimmten Peaks ist die „Chemie” der Säule und nicht deren Packungsqualität verantwortlich.
Hier besprochene Veränderungen finden vor allem an der Oberfläche von polaren stationäten Phasen und in einem polaren Milieu statt. Also: Relativ polare Phasen wie C₈ C₄, Diol, CN usw. sollten bei der Lagerung über längere Zeiträume (mehrere Monate) lieber in Acetonitril/Wasser als in Methanol/Wasser gelagert werden.
Obwohl wir im vorliegenden Fall eine massive Veränderung der Oberfläche im Sinne der Chemie haben (s. Unterschied in den zwei Chromatogrammen), bleibt die Peakform der neutralen Aromaten weiterhin gut, auch deren Retentionszeitverschiebung hält sich in Grenzen. Das bedeutet, dass solche Analyte wie z. B. Toluol nicht geeignet sind, solche Veränderungen sichtbar zu machen: Neutrale, „harmlose” Analyte sehen fast immer tadellos aus. (Frage: Was für Substanzen werden von der Säulenhersteller zur Erzeugung der Belegchromatogramme verwendet, die bei neuen Säulen immer beigelegt werden?...). Wenn Sie also ein Interesse daran haben sollten zu erfahren, wie „gut” wirklich Ihre Säule noch ist, sollten Sie bewusst problematische Substanzen (z. B. Benzylamin) injizieren und nicht solche, die immer gut aussehen. Es sei denn, sie analysieren einfache, neutrale Moleküle. In diesem Fall sind Veränderungen, wie hier besprochen, für Sie kaum relevant.