Kleine, leicht zu verdauende HPLC-Tipps, Teil 3

Der HPLC-Tipp 08/2008von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Heute möchte ich zum Abschluß der „kleinen” für dieses Jahr diverse Themen ansprechen.

Basisliniendrift

ACN/TFA (Trifluoressigsäure) ist ein beliebter Gradient in der RP-HPLC. Bei niedrigen Wellenlängen hat man allerdings oft mit einer sehr störenden Drift zu tun und im Falle von kleinen Peaks wird deren Integration dadurch stark erschwert. Abhilfe: Statt der üblichen Konzentration von 0,1% TFA kann man einfach 0,085% TFA verwenden. Vielleicht wird die Selektivität kaum verändert, man stellt jedoch eine wesentlich schwächere Drift fest.

Irreversible Sorption an Oberflächen

Über dieses leidige Thema haben wir uns des öfteren unterhalten. Dennoch möchte ich es wieder aufgreifen, weil viele Reproduzierbarkeitsprobleme mit der Peakfläche damit zusammenhängen. Und es sind nicht nur Proteine, die gerne an diversen Oberflächen haften bleiben. Es können auch andere große organische Moleküle sein, wie Tocopherole, Farbstoffe, Zucker. Wenn die Pumpe und der Injektor ok sind und es liegen Peakflächen-schwankungen vor und man kann andere offensichtliche Gründe ausschließen (instabile Probe, falsche Wellenlänge bzw. alte Lampe, Aufkonzentrierung der Probenlösung), würde ich mich dieser eventuell vorliegenden Physisorption durch Adhäsion widmen: Anlage mit 6N HNO₃ passivieren, noch besser möglichst Stahloberflächen vermeiden, z. B: Stahl- gegen PEEK-Kapillaren ersetzen, beim Hersteller nachfragen, ob er für den Autosampler statt einer Stahlnadel auch eine aus Messing im Programm hat. Darüber hinaus Teflon-Oberflächen vermeiden, Glasoberflächen inertisieren (s. HPLC-Tipp im Juli).

„Kunststoff-Verbot” im Labor im Falle von empfindlichen Gradiententrennungen...

Weichmacher (Phthalate) gibt es überall – man hat sie auch im Nordpol nachgewiesen. Es liegt nahe, dass bei Gradiententrennungen im Spurenbereich sie stören können - sofern bei der HPLC-Analytik Plastikgegenstände (Pipetten, vials usw.) verwendet werden. In einem Labor hat man Monate lang mit einem kleinen Peak gekämpft, der stets an einer bestimmten Stelle im Chromatogramm eluierte. Um es kurz zu machen: Das war ein Phthalat aus dem PVC-Rohr einer neu eingebauten Klimaanlage. Erst ein Röhrchen mit Aktivkohle auf dem Eluentenreservoir löste das Problem. Übertrieben formuliert aber im Kern richtig: In einem HPLC-Labor für Spurenanalytik haben Plastikutensilien nichts verloren.

Methodentransfer/-Übernahme – sind es die gleichen, konstanten Bedingungen?

Ein Methodentransfer bzw. Methodenadaption klappt in einem Labor nicht, obwohl man peinlichst auf Einhaltung aller chromatographischer Parameter geachtet hat und auch über die gleiche Hardware verfügt. HPLC ist leider und gleichzeitig Gott sei Dank eine sehr empfindliche Methode, kleinste Änderungen können zu mangelnder Reproduzierbarkeit führen. Nachfolgend einige Beispiele aus diversen Projekten:

Es liegt eine Temperaturdifferenz zwischen den Standardlösungen und den Proben vor. Z.B. sind die Standards temperiert aber die Proben, die von außen kommen, können eine recht unterschiedliche und schwankende Temperatur aufweisen (Unterbrechung der Kühlkette, unterschiedliche Aufbewahrungsorte, Engpass beim Probeneingang und –verteilung usw.).
Oder die Validierung wurde in einem älteren Labor mit einer kaum funktionierenden Klimaanlage durchgeführt und die HPLC-Anlage war zufällig direkt am Fenster, welches zog...
Oder aber die Validierung wurde im Sommer durchgeführt, als bekanntlich eine andere Feuchtigkeit als im Winter herrscht.
Oder der Autosampler mit dem die Validierung durchgeführt wurde war für eine kleine Spritze mit einer großen Schleife qualifiziert, der (baugleiche) Autosampler im Routinelabor jedoch für die große Spritze und die große Schleife.

Also, denken Sie bitte in solchen Fällen auch an etwas ungewöhnliche Ursachen...