Einfluss des Probenlösungsmittels auf die Trennung

Der HPLC-Tipp 10/2008 von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Wir haben uns bereits an dieser Stelle über den Einfluß der Probenlösung auf die Peakform und somit auf die Trennung unterhalten. So führt ein zu starkes Probenlösungsmittel (Probe z. B. in mehr MeOH oder ACN im Vergleich zum Eluenten) zum Fronting oder gar zu Doppelpeaks, andererseits führt ein schwaches Probenlösungsmittel – mehr Wasser im Vergleich zum Eluenten – zur Aufkonzentrierung am Säulenkopf und somit zu einer Verbesserung der Peakform. Die Folge lautet im zweiten Fall: Verbesserung der Auflösung bzw. Erniedrigung der Nachweisgrenze. In letzter Zeit haben wir uns intensiv mit der Injektion befasst und haben mehrere Variablen untersucht. Heute möchte ich Ihnen den möglichen Einfluß des organischen Lösungsmittels und des pH-Wertes kurz vorstellen. Im Januar werden wir uns dann über Überladungseffekte unterhalten.

Die Lösung

Für die Tests haben wir eine Mischung aus Ascorbinsäure, Uracil, Phenol, Pyridin, 3-Hydroxy-/4-Hydroxybenzoesäure, Fluoren, Fluorenon im isokratischen Modus bei 30°C an mehreren RP-Säulen mit einem Eluenten aus 60/40 ACN/Phosphatpuffer, pH-Wert 2,7, 20 mMol bei variierendem Fluß, Injektionsvolumen usw. getrennt. Die Probe wurde in den Eluenten gelöst, alternativ wurde ACN gegen MeOH ersetzt, s. Abb. 1 (Gesamtchromatogramm, blau:ACN, grün:MeOH) und Abb.2 (Ausschnitt, blau:ACN, grün:MeOH).

: Abb. 1 Einfluss des organischen Lösungsmittels in der Probenlösung auf die Trennung, Erläuterungen, s. Text

: Abb. 1a Einfluss des organischen Lösungsmittels in der Probenlösung auf die Trennung, Erläuterungen, s. Text

Das organische Lösungsmittel beeinflußt die Elution der neutralen Komponenten wie z. B. Fluoren und Fluorenon bei 5,5 min und 8,2 min nicht, wohl aber die der polaren/ionischen. Während in MeOH/Puffer als Probenlösungsmittel Pyridin und 3-Hydroxybenzoesäure koeluieren, erfolgt in ACN/Puffer als Probenlösungsmittel deren Aufspaltung, s. Abb. 1a und 1b.

Abb. 2 auf der folgenden Seite zeigt den Einfluss des pH-Wertes der Probenlösung auf die Trennung:

Oberes Bild: Probe im Eluenten, pH-Wert 2,7
Mittleres Bild: Wie oben, pH-Wert jedoch 1,6
Unteres Bild: Wie oben, pH-Wert 5,6

: Abb. 2 Einfluss des pH-Wertes der Probenlösung auf die Trennung, Erläuterungen, s. Text

Ein stark saurer pH-Wert (mittleres Bild) verschlechtert die Trennung massiv, während ein pH-Wert von 5,6 eine leichte Verbesserung der Auflösung gegenüber der Injektion aus dem Eluenten hervorruft (unteres vs. oberes Bild).

Das Fazit

Der pH-Wert der Probenlösung sowie das zum Auflösen verwendete Lösungsmittel können die Peakform und somit die Auflösung beeinflussen. Davon sind vor allem polare/ionische Analyten betroffen. (Für Interessierte: Das hängt mit der lokalen Überladung der Säule aufgrund der dualen Wechselwirkungen der Analyten mit den funktionellen Gruppen und deren Beeinflussung durch Lösungsmittel – Verteilung – und pH-Wert – Ionisierungsgleichgewicht - zusammen). Es empfiehlt sich sowohl bei Optimierungs- als auch bei Robustheitsversuche diesen Einfluß gezielt zu untersuchen. Dies vor allem bei Methoden für Proben, die von außerhalb kommen und deren Konstitution variieren könnte – ohne dass jene Info von den Auftraggebern immer an das analytische Labor weiter gegeben wird: Forschungsproben, Betriebsproben, Kundenproben etc.