Die „Kleinen” im Sommer...

Der HPLC-Tipp 06/2009 von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Liebe Leser,

wie in jedem Sommer werden wir uns auch heuer in den Monaten Juni-August mit kleinen, leicht „bekömmlichen” HPLC-Tipps beschäftigen. Im Juni- und im Juli-Tipp geht es um eine unerwartete Verschiebung der Retentionszeit, d.h. um eine, die ohne eine bewusste Veränderung seitens des Anwenders erfolgt ist, also: Es wurde keine längere/kürzere/dünnere Säule eingebaut oder die Flussrate geändert. Grundsätzlich liegt in einem solchen Fall eine Verschiebung der Retentionszeit an einer Änderung der Temperatur, der stationären Phase (d.h. „Chemie” der Oberfläche) und des Eluenten. Ungewollte Temperaturänderung stellt ein eher seltenes Problem dar, deswegen werden wir uns heute mit der stationären und im Juli mit der mobilen Phase befassen.

Veränderung der stationären Phase

Bemerkung

Es geht hier um eine Veränderung im Sinne der „Chemie”, d.h. nicht um eine Abnahme der Packungsqualität, die bei einer mehr oder weniger konstanten Retentionszeit zu einer Verschlechterung der Peakform (Peakverbreiterung, Tailing, Doppelpeaks) führen würde.

Einige Gründe

Eine eher polare stationäre Phase (C₈, C₄, NH₂, CN, Diol etc.) wird für eine längere Zeit in MeOH/Wasser gelagert und es kommt dadurch zu einer partiellen Hydrolyse der funktionellen Gruppen („Bluten” der Säule). Der Charakter der Phase wird dadurch polarer, polare Analyte eluieren anschließend später, apolare, früher. Dies kann sogar geschehen, wenn eine Säule mit bifunktionaler Oberfläche (polare und apolare Gruppen) über Nacht ohne Fluss bei 40 °C in MeOH/Wasser stehen gelassen wird (Tipp: Hans- Joachim Kuss, Uniklinikum München).
Ein Eluent mit 0,1% TFA (Trifluoressigsäure) wird über Nacht bei 40-45 °C über eine hydrophobe, endcappede C18-Phase gefördert. Ursprünglich liegt der pH-Wert bei ca. 2. Aufgrund der relativ hohen Temperatur erniedrigt sich der pH-Wert auf 1,9 oder gar 1,8. Das aber ist der kritische Wert bei dem kurze funktionelle Gruppen (s. weiter oben) anfangen, hydrolysiert und somit abgespalten zu werden.
Bei den endcappeden Phasen wird oft die Trimethylsilylgruppe - eben eine sehr kurze funktionelle Gruppe! - zur Maskierung der SiOH-Gruppen verwendet.
Diese Gruppe kann nun durch die Erniedrigung des pH-Wertes teilweise abgespalten werden. Das ist der Grund, warum viele moderne, hydrophobe, endcappede C₁₈-Phasen im schwach Alkalischen zumindest zum Teil befriedigend stabil sind, im Sauren jedoch oft recht schnell „in die Knien” gehen.
Bei einigen Probenmatrices erfolgt eine langsame, kontinuierliche, erst mit der Zeit zu bemerkende Änderung der stationären Phase: Manche Bestandteile der Probenmatrix (Lipide, Polymere, Cellulose, Magnesiumstearat, Zucker, Proteine usw.) können langsam aber stetig irreversibel an der RP-Oberfläche adsorbiert werden. Dadurch ändern sich die Eigenschaften der stationären Phase, Ergebnis: Verschiebung der Retentionszeit, häufige Begleiterscheinung: Abnahme der Bodenzahl. Zu dieser Problematik gehört auch die langsame Sorption von Ionenpaarreagenzien aus der mobilen Phase.
Es sei zum Schluss auf einige Spezifika hingewiesen: Manch eine polare Säule reagiert sehr empfindlich auf bestimmte Reagenzien. So entsteht z.B. an einer NH₂-Phase bei Anwesenheit von Glutaraldehyd eine spontane Vernetzung, die Phase ist irreversibel beschädigt. Oder aber mag manch eine Säule beim Umspülen keine abrupte Änderungen obschon eigentlich „normale” Mischungen verwendet werden, ein Beispiel dazu: Das häufige Umspülen einer Säule von 50/50 ACN/Wasser auf 50/50 MeOH/Wasser verursacht eine relativ kurze Lebensdauer der Säule – und in diesem Zusammenhang eine Veränderung der Retentionszeit – während ein kurzer Zwischen-Spülschritt mit reinem MeOH vor der Verwendung der 50/50 MeOH/Wasser-Mischung zu einer merklichen Verlängerung der Lebensdauer führt.