Wenn „U(H)PLC” als U(H)PLC genutzt werden soll...

Der HPLC-Tipp 10/2009 von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Seit Einführung der UPLC von Waters im Jahre 2004 haben mehrere Anbieter nachgezogen, in der Zwischenzeit wird eine ganze Reihe von UHPLC, Fast LC, RRLC usw. Systeme angeboten. Diese Geräte machen z.Z. ca. 10% der Neukäufe aus. Die Erfahrungen sind durchaus positiv, man sollte sich jedoch einigen Sachen bewusst machen.

Die Lösung

Manchmal werden U(H)PLC-Geräte lediglich zur Verkürzung der Analysenzeit von alten Methoden benutzt. Beispielsweise wird aus einem alten 20-30 min-Lauf mit 5-10 Peaks mithilfe der U(H)PLC ein 5-8 min-Lauf. Wenn dies in etwa das avisierte Ziel war und man damit zufrieden ist, ist alles ok, der Methodentransfer HPLC-U(H)PLC sollte funktionieren und im Alltag dürfte es hier keine größeren Probleme geben. Ich wende mich hier eher an KollegInnen, die tatsächlich U(H)PLC betreiben bzw. betreiben werden: 20-50 mm x 2,1 mm Säulen, 1,7-1,9 µm-Teilchen, ca. 800-1000 bar, Trennungen unter 3-5 min. In diesem Fall sollte man unbedingt den – mittlerweile offen ausgesprochenen und konkreten – Empfehlungen der Anbieter folgen. Sonst werden die Möglichkeiten der Geräte nicht genutzt, jene bekommen ungerechterweise schlechte Noten und man/frau selbst ist recht unzufrieden, mitunter auch frustriert.

Dazu stellvertretend einige Beispiele:

Ab ca. 800 bar aufwärts und kurzen Säulen sollte der Temperaturgradient in der Säule nicht vernachlässigt werden („heat of friction”)! Manchmal ergibt sich eine bessere Peakform, wenn bei tieferen Temperaturen, z. B. 15° C, gemessen wird.
Gradient-grade Qualität von Lösungsmittel reicht nicht aus, es empfiehlt sich ein zusätzliches Filtrieren über 2 µm-Filter.
Trivial, dennoch immer wieder erwähnenswert: Will man die gewohnte Lebensdauer der Säulen erhalten, ist bei schwierigen Matrices eine sehr gründliche Probenvorbereitung das „A” und „O”, ferner sollte der Dichtungsabrieb im Auge behalten werden.

Zum Schluss zwei Beispiele, die vielleicht zur Sensibilisierung beitragen könnten:
1. Es wurde in einer UPLC-Anlage einmal die vorhandene Kapillare als „normales” Verbindungsstück und einmal eine Wärmeaustauschkapillare, ca. 20 cm, 0,10 mm ID zwischen einer 50 mm x 4,6 mm, 3µm-Säule und dem Detektor (PDA) verwendet. Durch das etwas größere Volumen der Wärmeaustauschkapillare ergab sich ein nur minimal größerer Tailingfaktor, s. Abb. 1, rechts: Statt ca. 1,28 nun ca. 1,30-1,31.

: Abb. 1 Zum Tailingfaktor abhängig von der Richtung der eingebauten Kapillare, Details, s. Text

Anschließend wurden sowohl das Verbindungsstück als auch die Kapillare „andersherum” angeschlossen und die sich ergebenden Tailingfaktoren durch Doppelbestimmung verglichen, s. Abb. 1, links: Während der Tailingfaktor im Falle des Verbindungsstückes praktisch gleich geblieben ist (ca. 1,26-1,28), erhöhte sich im Falle der Kapillare der Tailingfaktor von ca. 1,3-1,31 auf ca. 1,38-1,40.

Ergebnis:
Auch bei einem konstant gebliebenen Volumen einer Kapillare kann ein etwas „schlechterer” Anschluss an einem Ende der Kapillare die Peaksymmetrie beeinträchtigen. Ein derartiger Effekt ist bei den üblichen, längeren HPLC-Säulen und längeren Retentionszeiten kaum feststellbar.

2. Der Tailingfaktor wurde bei vier Temperaturen (30, 40, 50 und 60 ° C) und einem konstanten Fluss von 0,7 ml/min bestimmt, s. Tab. 1

Ergebnis:
Eine schnelle Kinetik aufgrund einer Erhöhung der Temperatur von 30 auf 60 ° C und der damit verbundenen Erhöhung der Bodenzahl kann die Verschlechterung der Peakform/Peaksymmetrie im Falle von sehr frühen Peaks nicht ausgleichen. Trotz der Verwendung von U(H)PLC-Geräten sollte man sich genau überlegen, wie „schnell” schnelle Trennungen sein sollten.

Das Fazit

Fluss (ml/min)	Temperatur (° C)	Retentionszeit (min)	Tailing (interner Faktor)
0,7	60	0,57	595
0,7	50	0,64	330
0,7	40	0,73	280
0,7	30	0,85	250

Sollen U(H)PLC-Geräte an den Grenzen der Spezifikationen genutzt werden, muss man ziemlich umdenken, sonst bleibt manches wie Lebensdauer der Säulen, Peaksymmetrie, Ausfallzeiten wg. Suchen von Problemen usw. hinter den Erwartungen zurück. Oder aber man ist bereit, bescheidener zu werden...