Integration von Peaks auf einer driftenden Basislinie

Der HPLC-Tipp Januar 2010 von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Bei Gradiententrennungen oder im Falle von Matrix-belasteten Proben müssen oft Peaks, die sich auf einer mehr oder weniger stark driftenden Basislinie oder auf einem flachen „Buckel“ befinden, integriert werden. Die Frage ist nun, wie tut man so etwas am besten? Da die meisten Anwender nicht über Peakhöhen auswerten, wird hier auf diese – oft sinnvolle – Möglichkeit nicht weiter eingegangen.

Die Lösung

Nachfolgend werden für zwei Fälle Lösungsansätze vorgeschlagen, die sich nach aufwendigen Überprüfungen als das kleinere Übel erwiesen haben (1).

1. Nicht-aufgelöste Peaks auf einer abfallenden Basislinie, s. Abb. 1.
(Das Beispiel wurde freundlicherweise von Dr. Hans-Joachim Kuss zur Verfügung gestellt, für eine detaillierte Diskussion, s. (2)

: Abb.1 Originalinjektion der Probe, Details, s. Text

Vorgehen:
Falls benachbarte Peaks eine Auflösung von R = 2 aufweisen, wird der tiefste Punkt zwischen den Peaks markiert, Abb. 2, und die Punkte miteinander verbunden, s. Abb. 3. Anschließend wird die Basislinie vom ursprünglichen Chromatogramm abgezogen und das Differenzchromatogramm per Lotfällung integriert, s. Abb. 4.

: Abb. 2 Markieren des tiefsten Punkts zwischen zwei benachbarten Peaks, Details, s. Text

: Abb. 3 Verbinden der markierten Punkte zum Zeichnen der Basislinie, Details, s. Text

: Abb. 4 Differenzchromatogramm aus Abb. 1 und 3, Details, s. Text

2. Peaks auf der aufsteigenden Basislinie eines Gradientenlaufs
Vorgehen:
A. Als erstes wird die Probe injiziert, Abb. 5
B. Anschließend wird ein „Blank“ injiziert, Abb. 6
C. Jetzt muss überprüft werden, in wie weit die Methode robust ist, d.h. ob die Retentionszeiten konstant bleiben. Dazu wird die Probe z. B. 5 Mal und der „Blank“ 2 Mal injiziert und die Chromatogramme übereinander gelegt, Abb. 7.

: Abb. 5 Injektion einer Probe, Details, s. Text

: Abb. 6 Injektion eines „Blanks“, Details, s. Text

: Abb.7 Übereinanderlegen von Chromatogrammen nach wiederholten Injektionen zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit einer Methode, Details, s. Text

Im vorliegenden Fall zeigt sich, dass die Retentionszeiten in der Tat konstant bleiben, auch der „Blank“ kann reproduziert werden, die Methode ist also robust. Nun wird vom Original-Chromatogramm der „Blank“ („Blindgradient“) abgezogen, die Integration der Peaks stellt kein größeres Problem dar, Abb. 8.

: Abb. 8 Differenzchromatogramm aus Abb. 5 und 6

Die oft recht leidige Diskussion, wie nun im ursprünglichen Chromatogramm die Basislinie zu ziehen ist, entfällt.

Variante: Vom Original-Chromatogramm kann auch ein Chromatogramm abgezogen werden, das entsteht, wenn eine Lösung, die Matrix, Placebo usw. jedoch keinen Analyten enthält, injiziert wird.

Das Fazit

Die meisten Softwareprogramme erlauben ein manuelles/nachträgliches Ziehen der Basislinie sowie das Abziehen von Basislinien/“Blanks“/Matrixinjektionen von Originalchromatogrammen. Bei robusten Methoden und damit gegebener Reproduzierbarkeit von Retentionszeiten und Peakflächen sollten diese Möglichkeiten ins Auge gefasst werden. Jedenfalls sind die erhaltenen Peakflächen „richtiger“ als wenn Peaks auf „Buckel“/driftende Basislinien individuell integriert werden. Im letzten Fall sind Ergebnisse nur schwer mit anderen Laboren vergleichbar.

(1) Mike Hillebrand, Hans-Joachim Kuss, Stavros Kromidas, unveröffentlichte Ergebnisse
(2) Hans-Joachim Kuss, „Integration Errors“, in Hans-Joachim Kuss and Stavros Kromidas (Edrs.) Quantification in LC and GC, A Practical Guide to Good Chromatographic Data, Wiley-VCH, 2009, ISBN 978-3-527-32301-2