Effektives Spülen einer RP-HPLC-Säule

Der HPLC-Tipp Februar 2010 von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Dass eine HPLC-Säule ab und zu gespült werden muss, ist eine Binsenweisheit. Nur, wie macht man so etwas effektiv – es soll gründlich und es soll auch ökonomisch sein. Wenn Sie im Labor eine entsprechende Spülprozedur haben mit der Sie zufrieden sind, besteht natürlich kein Handlungsbedarf. Und Sie sind wahrscheinlich zufrieden, wenn Sie erstens bei Ihren Läufen keine Geisterpeaks, keinen Memoryeffekt, keine „Buckel“ etc. feststellen und zweitens die ganze „Spülerei“ keine 2-3 Stunden in Anspruch nimmt. Sollte allerdings einer dieser zwei Fakten zutreffen, bestünde womöglich Optimierungspotenzial. Nachfolgend finden Sie einen Vorschlag.

Die Lösung

1. Verunreinigungen
Vorbemerkung als Erinnerung

„Ähnliches löst ähnliches auf“, d.h. organische Lösungsmittel befreien die Säule von organischen Verunreinigungen, polare dagegen verdrängen polare Verunreinigungen. Je hartnäckiger der „Dreck“, umso stärker (polarer/apolarer) muss das Lösungsmittel sein.

In aller Regel reicht zum Spülen ein steiler Gradient von 100% Wasser auf 100% Acetonitril innerhalb von 15 min bei 2 ml/min und ca. 40° C. Sollten Sie ein komisches Gefühl haben, 100% Wasser zu verwenden, können Sie ruhig mit 95% oder 90% Wasser starten. Durch dieses Procedere eluieren Sie mit dem „vielen“ Wasser die polaren, und mit dem „vielen“ Acetonitril die apolaren Verunreinigungen.

Vermuten Sie hartnäckige polare Verunreinigungen?

Injizieren Sie in diesem Fall 2-3 Mal ca. 100 µl 0,01 N Salpetersäure (alternativ: Ca. 1-5% Ameisensäure) oder 0,01 N Natronlauge, alternativ: Verdünntes Ammoniak.

Vermuten Sie hartnäckige apolare Verunreinigungen?

Injizieren Sie in diesem Fall 2-3 Mal ca. 100 µl frisches(!) Tetrahydrofuran (THF) und oder Dimethylsulfoxid (DMSO), alternativ: Dimethylformamid (DMF).

Um zu prüfen, ob und wenn ja, welche der oben beschriebenen Einzelinjektionen zusätzlich zum Spülgradienten Wasser-Acetonitril notwendig sind – um nicht mehr zu machen als notwendig -, würde ich der Reihe nach das Ganze bei ca. 220-230 nm ausprobieren, bzw. bei der möglichniedrigste Wellenlänge abhängig vom Lösungsmittel (THF!). Auch wenn im Chromatogramm keine Peaks zu sehen sein sollten, würde ich auf jeden Fall mindestens Wasser, Isopropanol und Acetonitril injizieren, um sicher zu gehen, dass die Injektionsnadel sauber ist.

2. Sonstige störende Komponenten, die herunter gespült werden sollten

2.1. Algen, Pilze, Bakterien

Spülen der Anlage inkl. Säule mit Isopropanol oder noch besser mit einer 3%igen Wasserstoffperoxid-Lösung.

2.2. Schwermetallionen, die evtl. mit Ihren Analyten Komplexe bilden könnten

Spülen mit einer 10-20 mMol Ethylendiamintetraacetat (EDTA)-Lösung, alternativ: 2- 5% methanolischen EDTA-Lösung.

Das Fazit

Wenn Geisterpeaks etc. erscheinen: Säule ausbauen und 100 µl Acetonitril, Isopropanol, Tetrahydrofuran usw., s. oben, bzw. 100 µl heißes Wasser, 0,01 N Salpetersäule, Natronlauge, s. oben, bei niedriger Wellenlänge injizieren. Ist ein Peak da? Das Problem liegt vermutlich am Injektor oder an einem Fitting usw. jedenfalls an der Hardware. Wenn nichts zu sehen ist, Säule wieder einbauen und Procedere wiederholen. Ist ein Peak da? Der Peak kommt von der Säule. Besteht trotz Spülen das Problem weiterhin, d.h. haben Sie immer noch einen Peak im Chromatogramm? Ich würde in diesem Fall mir den Degasser vorknöpfen.