NOVIA GmbH - Ihr Partner für Analytik - HPLC Tipp Juli/August 2010

Der Der HPLC-Tipp im Juli/August von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Im Juni haben wir uns über den Eluenten unterhalten. Bleiben wir doch auch heute beim Thema, der Eluent ist eine schier unendliche Geschichte…

1. Von „Gebirgen” in der Basislinie und Läufe im Sommer und im Winter im Falle von ACN/Wasser-Eluenten

Der Fall

Sagen wir, Ihnen ist aufgefallen, dass Sie im Sommer mit ACN/Wasser- bzw. Puffer-Gemischen mehr Probleme haben als im Winter (Basislinieschwankungen, evtl. zusätzliche, breite Peaks etc.).

Mögliche Erklärung

Eine frisch hergestellte Mischung beispielsweise von 85/15 ACN/Wasser- bzw. Puffer ist bekanntlich kalt und wir haben zunächst auch keine Probleme. Es kann nun passieren, dass im Sommer trotz Klima-Anlage die Temperatur im Labor 27-29 °C beträgt. Die höhere Temperatur begünstigt die Bildung von Polymeren – ein bekanntes Problem von Acetonitril. Im Winter herrscht im Labor tatsächlich eine Temperatur von z.B. 22 °C, die Probleme existieren nicht oder sie sind wesentlich geringer. Also: Die Polymerisation ist eine Funktion der aktuell herrschenden Temperatur.

Lösungsvorschlag

Sie filtrieren Ihren Eluenten über ein Empore SDB-XC Polystyroldivinylbenzol-Filter der Fa. 3M. In Abb.1, die freundlicherweise von Herrn Christian Schulz (christian.schulz@boehringer-ingelheim.com) zur Verfügung gestellt wurde, kann man den Effekt klar erkennen: Der obere Verlauf entspricht der Basislinie (Gradientenanstieg) vor, der Untere nach der Filtration. Es ergibt sich eine geringere UV-Absorption um ca. Faktor 5.

: Abb.1 Zum Effekt des Filtrierens von ACN-Eluenten, Details, s. Text

Empfehlungen

Fahren Sie wenn möglich nicht mit 100% ACN in einem Kanal. Die Zugabe von 0,3-0,5% Wasser zum ACN kann die Polymerisation verhindern/minimieren.
Reine Lösungsmittel (ACN, MeOH, Puffer, etc.) in einem Kanal fahren ist bei der Methodenentwicklung eine effektive, übliche und vernünftige Praxis – so kann man einfach und schnell unterschiedliche Mischungen ausprobieren. Später jedoch, wenn die Methode „steht” und sie im Routinebetrieb eingesetzt wird, würde ich schon ein Vormischen der Eluenten empfehlen, insbesondere, wenn Sie Läufe bei niedrigen Wellenlängen haben: Die Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten ist besser und man bekommt eine ruhigere Basislinie.

Nachfolgend auf die Schnelle die Vorteile des Vormischens:

Kein Wachstum von Mikroorganismen und Algen in Wasser/Puffer-Kapillaren
Keine/geringere Gefahr für Polymere bei ACN
Werden Methanol und Wasser erst in der Mischkammer gemischt (Hochdruckgradient) ergibt sich wegen der dort entstehenden Wärme mehr Probleme mit Luftblasen
Keine Durchmischungsprobleme bei „schlechter” Mischkammer und/oder großen Unterschieden in der Viskosität der zu mischenden Eluenten. Dadurch haben wir eine geringere Drift und eine ruhigere Basislinie, Ergebnis: Bessere Empfindlichkeit, kleinere Nachweisgrenze, geringere Probleme bei der Integration von kleinen, tailenden Peaks
Kleinerer pH-Wert und Pufferstärke-Gradient

Und noch etwas zum Schluss:

Eine unruhige Basislinie mit „Gebirgen” im Sommer zeugt nicht unbedingt von Urlaubsträumen Ihrer Anlage sondern könnte folgende Ursache haben: Die Klimaanlage muss im Sommer im Vergleich zum Winter mehr Luft „pusten”, um die Temperatur nicht ansteigen zu lassen. Bekanntlich reagieren einige Detektoren recht empfindlich auf Luftzug. Jene bekommen keines Falls eine nasse Nase aber Sie evtl. Probleme mit der Basislinie.

2. Saurer Eluent – es muss nicht immer Phosphorsäure oder TFA sein

Kurze Hinweise, wenn Sie es sauer brauchen...

Methansulfonsäure ist eine interessante Alternative für den pH-Wert-Bereich zwischen ca. 2-3
Auch Schwefelsäure ist nicht uninteressant, vor allem im unteren Wellenlängenbereich, da ihre UV-Absorption gering ist
Denken Sie schließlich evtl. auch an Sulfaminsäure für den pH-Wert Bereich = ca. 2 als Alternative zur Phosphorsäure und vor allem zur TFA: Gute Peakform, Sulfaminsäure ist LC-MS-fähig und bis ca. 200 nm gibt es kaum Probleme mit der UV-Absorption.