Trends in der HPLC

Vom 26.-30 Juni 2005 fand in Stockholm, Schweden, das „29. International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques „ statt. Dr. Stavros Kromidas, der das Symposium besuchte, zeigt im nachfolgenden Bericht Schwerpunkte und Trends auf.

2…3 Worte zu Beginn

Das wichtigste zuerst: Nach meiner Ansicht war dieses Symposium aus wissenschaftlicher Sicht eines der besten dieser Reihe. Zunächst einige Rekord-verdächtige Zahlen aus Stockholm: Man registrierte ca. 800 Besucher, zusammen mit Mitarbeitern von ausstellenden Firmen (ca. 80 Aussteller) und den Vortragenden zählte man insgesamt ca. 1060 Teilnehmer, die Zahl der Poster betrug ca. 600. USA, Schweden, Spanien, Deutschland und Japan waren die am stärksten vertretenden Länder. Der Frauenanteil bzgl. aktiver Beteiligung lag im Verhältnis zu älteren Symposien bemerkenswert hoch: Der Anteil der Poster-Autorinnen lag bei 37%, 22% der Vortragenden waren ebenfalls Frauen. Es soll ferner ein dickes Lob an das wissenschaftliche Komittee ausgesprochen werden: Es sorgte dafür, dass 19% der Vorträge von Jungwissenschaftler gehalten wurde. Jene nutzten ihre Chance mit Bravour aus – ich habe mich bei keinem einzigen dieser Vorträge gelangweilt. Das ganze Umfeld kann man kurz wie folgt beschreiben: Sehr lockere, ungezwungene Atmosphäre, natürlicher, direkter Umgang (z. B. kein Titel an den Namensschilder), hervorragendes wissenschaftliches Niveau, wirklich neue, frische Ideen, bzw. das Aufgreifen von alten, bereits länger ausgesprochene Hinweise und Zusammenhänge (zwar spät aber immerhin…). Manches Preis/Leistungsverhältnis am Rande, so z. B. beim Dinner, war gelinde ausgedruckt mehr als ärgerlich, dafür haben die Schweden bei der Eröffnung durch ihre volkloristischen Darbietungen dem Symposium eine sehr liebenswürdige Note verliehen – aber das sind bei Gott Nebensächlichkeiten, kommen wir nun zum Wesentlichen.

Schwerpunktthemen, Applikationen, Trends

Vorbemerkung

An solchen Tagungen werden einem immer wieder die unterschiedlichen Facetten der HPLC bewusst: Auf der einen Seite das wissenschaftlich erreichbare und auch erreichte und auf der anderen Seite der Alltag in einem „real life“ HPLC-Labor. Sogar ich, der in beiden Welten halbwegs zu Hause ist, stolpere immer wieder über diesen, scheinbar immer größer werdenden Abstand. Dazu drei typische Beispiele:

Auf der einen Seite die „unverwüstliche“ 250 x 4,6 mm Säule und auf der anderen Seite kaum eine Beschäftigung mehr mit diesen „alten“ Techniken wie LC und Nano-LC: „In“ ist in der Zwischenzeit in Forschungsgruppen die Chip-HPLC. War sie noch vor fünf Jahren schon etwas besonderes, gab es in Stockholm bereits eine ganze Menge Vorträge und Poster von Anwendern – nicht von Anbietern! -, die über ihre (meist positive) Erfahrungen berichtet haben.
Auf der einen Seite Gehaltsbestimmung mittels HPLC ( 1 Peak, 5…10 min Retentionszeit) und auf der anderen Seite die Trennung von 5 Proteinen in 20 sec oder die Bestimmung von 10 fmol BSA oder die Trennung von 2.388 Peptiden sowie die Identifizierung von 860 Proteinen an einer 7 cm, 20 µm ID-Kapillare mittels eines 750 min Gradienten.
Auf der einen Seite die tag-täglich erfolgte 6-fache Injektion einer Standardlösung, Injektion der Kontrolle (natürlich Doppelbestimmung) evtl. noch ein Systemeignungstest dazu und auf der anderen Seite die on-line Information über den Gerätezustand und die Systemeignung : Durch die Verwendung von on-line Druck- und Temperatursensoren sowie Messung der Lampenenergie und der Leitfähigkeit erfährt man, Computer-unterstützt in real time, ob der Druck, Fluss und das Injektionsvolumen (und damit die Fläche) einer Kontrollinjektion stimmt – die Zeit-intensive Überprüfung vor der eigentlichen Messung entfällt: „Liquid Chromatography Process Control“, „Real Time Continous System Stability Test“.

„Dauerbrenner“ sind nach wie vor, Proteomics, Metabon(l)omics, CE/CEC, chirale Trennungen, Drugs und Biomarkers.

Wir erleben z. Z. des Weiteren dank der LC-MS(MS)-Kopplung, der Miniaturisierung und der 2D-Chromatographie ein Wiedererwachen der Umweltanalytik, weil wir mit Hilfe der drei genannten Tools in Selektivitäts-/Sensitivitätsbereiche vordringen können, die noch vor kurzem undenkbar waren. Folgende Themen wurden sehr kontrovers und ausführlich behandelt:

Theorie der Trennung
Schnelle LC-Trennungen

Neue stationäre Phasen wurden diesmal eher in Poster denn in Vorträgen vorgestellt (Ausnahme die Einführung von XBridge von Waters). Der präparativen HPLC, den Detektoren, der Lebensmittelchemie und der Chemometrie (sie ist im Kommen, „Chromatometrics“) wurde ebenso Aufmerksamkeit gewidmet aber nicht so stark wie den erstgenannten Themen. LC-MS(MS) hat den Charme des Neuen verloren und wird bereits auf einer breiten Basis als eine ganz „normale“, sehr leistungsfähige Technik genutzt: Fast ein Viertel der Poster hatte direkt oder indirekt LC-MS als Thema. Es folgen jetzt Details zu den Themen „ die Trennung“ und „schnelle Trennungen“.

Die Trennung

Es scheint so zu sein, dass man sich wieder der Trennung selbst, dem eigentlich Ziel der HPLC also, widmet. Man erlebt z.Z, wenn man will, so etwas wie „back to the roots“. Das ist erfreulich und passt zu dem Gesamtgeist des Symposiums: Man ist erstens etwas bescheidener geworden und ist nun bereit, sich mit vordergründlich „profanen“ Themen zu befassen wie „Methanol oder Acetonitril?“ „Temperaturerhöhung als Optimierungstool“ oder „Wie kann ich wirklich die Peakreinheit überprüfen?“. Zweitens werden alte Gewohnheiten und Denkschemata (üblicher Systemeignungstest, „viel hilft viel“ - also viele ähnlich erzeugte chromatographische Daten erhöhen die Sicherheit der Aussage -, „lückenlose“ Dokumentation sichert Qualität usw.) rigoros hinterfragt. Nachfolgend stichwortartig einige interessante Punkte aus diversen Vorträgen:

Methanol und Acetonitril sind nicht lediglich geeignet, um die Retentionszeit gezielt zu beeinflussen, sie nehmen aktiv am Trennungsprozess teil. Es gibt zwischen den zwei Lösungsmitteln wichtige Unterschiede (z. B. Methanol als Protonen-Donator und Acceptor), es lohnt sich demnach nach erfolgter Trennung, die Selektivität mit Hilfe des anderen Lösungsmittels zu überprüfen.
Nur durch unterschiedliche Wechselwirkungen – und speziell polare Wechselwirkungen – hat man überhaupt die Chance, bei Bedarf die Selektivität zu erhöhen und die Peakhomogenität zu überprüfen. In diesem Zusammenhang gelangt HILIC (polare stationäre Phase wie NH 2 und CN und üblicher RP-Eluent, meist mit recht hohem organischen Anteil) wieder in den Vordergrund, sind ja heute kleine polare Moleküle interessant.
Orthogonale Techniken (2D- oder gar Multi D-Chromatographie) werden wichtiger: Nur durch die multiplikative Erhöhung der Peakkapazität bei mehrdimensionalen Trenntechniken unter Verwendung übrigens von üblichen, kommerziell erhältlichen Modulen (z. B. Schaltventilen), kann man die Problematik von sehr komplexen Proben oder/und Matrices bewältigen. Es wurde von sehr vielfältigen Kombinationen für die zwei Dimensionen berichtet: NP- und RP-Säule, HILIC und RP, Klassische Phasen und Monolithen, Säule und Kapillare usw.
Bei Verwendung von entsprechend stabilen Säulen auf Zr- oder Titandioxid oder Titandioxid-Siliziumdioxid-Basis kann die Temperatur auf jenseits der 100 C-Grenze erhöht werden. Dies ermöglicht interessante Möglichkeiten: Sehr kleine Viskositäten, damit Verwendung von sehr kleinen Teilchen und Säulenkopplung in Serie möglich - die Druckerhöhung bleibt moderat. Sehr hohe Bodenzahlen und kurze Retentionszeiten bzw. Verbesserung der Auflösung, Verwendung des bei einer Temperatur um die 200 C „apolaren“ Eluenten Wassers, somit Verzicht auf organische Lösungsmittel („grüne HPLC“).

UPLC, Fast-LC oder Monolithen?

Die Zukunft der HPLC ist zweifelsohne eine Zukunft der schnellen Trennungen. Wie lange es dauert, bis die Zukunft tatsächlich zu Gegenwart wird, weiß natürlich im Moment niemand, dass sie aber so aussehen wird, steht für mich ziemlich fest. Ich kann mir kaum vorstellen, dass die HPLC in der heutigen Form wird lange bestehen können (obwohl ich zugeben muss, dass ich bereits in den 80er Jahren so gedacht habe – und ich lag falsch…). Die möglichen Wege dorthin heißen UPLC (hohe Drücke, 1,7 µm Material), Fast-LC (klassisches HPLC-Gerät, evtl. mit kleinen Hardware/Software-Modifikationen und 1,8...2 µm Material) und Monolithen, vorzugsweise in Kapillaren. In Stockholm wurde heftig diskutiert, welches Konzept nun das „beste“ sei. Halten wir fest, dass alle drei Alternativen offensichtlich gut funktionieren, jedenfalls waren die Berichte von Anwendern durchweg positiv – Erfahrungen , die mit den meinigen übereinstimmen. Zur Entscheidungsfindung sollte der Anwender vielmehr sehr genau prüfen, welches der angebotenen Konzepte zu seinen eigenen, konkreten Bedürfnissen passt. Einige der Fragen, mit denen man sich im Vorfeld einer Entscheidung auseinandersetzen sollte, wären beispielsweise folgende:

Hilft mir eine Retentionszeit von 30 oder 60 sec, wenn die Probenvorbereitung 5 min dauert? Wie viele Proben habe ich eigentlich am Tag?
Bin ich bereit, mich längerfristig an einem Konzept/an einer Firma ob einer – zweifelsohne! – hervorragende Technologie zu binden?
Was sind meine Mitarbeiter/Kontraktpartner eher bereit zu akzeptieren: Einen Fluss von 10-20 µl/min oder von 5 ml/min? Bei entsprechender Dimensionierung der Säule/Kapillare komme ich in beiden Fällen zu der gewünschten Verkürzung der Trennzeit.
Bin ich in der Lage, den enormen Zeitgewinn und die schnellere Information auszunutzen, oder beschränkt sich der Vorteil „nur“ in einer sehr kurzen Analysenzeit? Wenn die schneller gewonnene Information zur Optimierung des Produktionsprozesses beitragen kann, wenn ich viel mehr Ansätze (z. B. Stressproben bei unterschiedlichen Bedingungen, Zwischenprodukte eines Syntheseschrittes usw.) analysieren und somit zu gesicherten Aussagen kommen kann, wenn die Zeit für die Methodenentwicklung um Faktor fünf reduziert werden kann, usw. – dann sollte der Schritt zur UPLC/Fast-LC usw. lieber heute als morgen erfolgen. Es tut sich ein ungeahntes wissenschaftliches und wirtschaftliches Potential auf …

Hardware

Eine Premiere gab es nicht, vielmehr wurden neuere Produkte ausgestellt, die in jüngster Zeit eingeführt wurden bzw. Neuentwicklungen angekündigt, die auf der Analytica 2006 vorgestellt werden sollen. Stichwortartig einige Beispiele dazu:

Komplette HPLC-Anlage für € 6.000,00 (Knauer)
Hardware-Plattform für IC sowie für analytische, Micro-, Nano-HPLC (Dionex)
Neue Geräteserie „prominence“ (Shimadzu)
Universal-Massendetektor „LC-FID“ (ESA)
HPLC-Anlage bis 600 bar (Agilent)

Aufgreifen von alten Ideen, neue Denkweise

Wie bereits oben erwähnt, war dies ein Symposium in dem vieles hinterfragt bzw. in dem die Realisierung von „alten“ Ideen vorgestellt wurde. Obwohl manch ein Hinweis teilweise sehr lange zurück liegt, ist als äußerst positiv zu bewerten, dass in letzter Zeit tatsächlich etwas passiert. Einige Beispiele dazu:

Halasz wies 1975 auf die Notwendigkeit der Herstellung von entsprechenden Pumpen, um die Trennleistung von kleinen Teilchen auszunutzen (Realisierung von UPLC/Fast-LC in 2004,), Unger sprach bereits 1976 von den Vorteilen der Hybrid-Materialien, die effiziente Trennungen im Alkalischen ermöglichen sollen (erste kommerzielle Hybridmaterialien erst Ende der 1990er-Jahre), Trennung von Aminosäuren und Aminen an Kieselgel bereits in den 1980er-Jahre (Neue, Kromidas), nun Renessance der HILIC ab Anfang der 2000er-Jahre, schließlich sprachen einige wenige gegen den Trend Anfang der 1990-er Jahre von „Qualität“ statt von „Qualitätssicherung“ und dass es sinnvoll ist, Qualität nach „vorne“ zu verlagern statt hinterher „Qualität“ zu messen.

Folgende neue/wiederendeckte Ideen und Trends finde ich erwähnenswert:

Kleine Peaks im Chromatogramm, die diverse Verunreinigungen wieder spiegeln, sind in aller Regel ein Ärgernisgrund. Wenn man sich jedoch gerade mit diesem „Rauschen“ beschäftigt, kann man mit Hilfe der LC-MS-Kopplung interessante Informationen gewinnen: Verunreinigungen können als Marker für die Herkunft von Rohstoffen dienen, sie können Schwachstellen beim Herstellprozess aufzeigen, sie sind womöglich hilfreich, um charakteristische Methode/Produkt/Gerät-Matrices zu entwickeln.
Man sollte aus einer „High Throughput Analysis“-Mentalität zu einer „High Content of Information“-Mentalität kommen: Das Erzeugen von lediglich vielen Daten einer Qualität (z. B. chromatographische Daten nach einer RP-Trennung) hat bis dato kaum die erhofften Ergebnisse gebracht, Stichwort Kombi-Chem. Wahrscheinlich erhöht sich die Informationsdichte und damit die Qualität von Aussagen, wenn weniger aber dafür fundiertere Daten einer Probe erzeugt werden, z. B: Möglichst hohe chromatographische Auflösung und Überprüfung der Peakreinheit durch 2D-Trennungen, möglichst hohe Spezifität mit Hilfe von spektroskopischen Daten (DAD, MS, ICP, MALDI-TOF), möglichst genau Informationen über die Zielkomponente (Chiralität?, Biorelevanz?).
Statt einem Testen am Ende einer (Produktions)Kette mit dem Ziel „Qualität“ zu dokumentieren, soll Qualität durch ein richtiges, der Fragestellung angepasstes Design des Prozesses, generiert werden. Statt nachher zu prüfen (Qualitätskontrolle), sollen früh die einzelnen (Prozess)Schritte kontinuierlich optimiert werden (Qualitätssicherung). Je früher das Prüfen von kritischen Faktoren ansetzt, um so robuster kann die Methode/der Prozess gestaltet werden, um so geringer bleiben die Prüfkosten, vereinfacht ausgedrückt: Nicht tun und dann messen, erst überlegen dann tun.

Nicht zum ersten Mal kommen solche Initiativen und Gedanken aus Ecken, die manch einer – mangels Information! – gar nicht erwartet: Nämlich von „der“ Behörde, so z. B. von der FDA. Statt Druck auf Reglementierung (die nicht viel brachte) soll ein sanfter Druck geübt werden, um Systeme zur Gewährleistung von Qualität bereits in einem frühen Stadium zu implementieren („Modern Quality Management Techniques“, „Real Time Quality Assurance“). Ein Begriff, der in den nächsten Jahren zumindest in der Pharma immer häufiger anzutreffen sein dürfte lautet: PAT (Process Analytical Technology). Die Analytik soll mit ihren Möglichkeiten den gesamten Prozess begleiten, dazu bedarf es nicht unbedingt hoch-komplizierten Techniken. PH-Wert-, Temperatur-, Feuchtigkeits-, Partikelgrößemessungen usw. an der richtigen Stelle zum richtigen Zeitpunkt offenbaren die kritischen Punkte eines Prozesses. Die Devise lautet, Minimierung des Risikos durch ein frühes Prüfen und evtl. Eingreifen.

Zusammenfassung

Miniaturisierung schreitet voran, die großen Hersteller bieten jetzt, recht ausgereifte Komplett-Lösungen von der Hardware über die Säule bis zur angepassten Software an. Dieser Weg wird konsequent gegangen. „Nano-structures“, „microfluidics“, „nanotechnology“ sind Techniken für (mindestens) „übermorgen“.
2D- sowie Multi D-Chromatographie dürfte weiter an Bedeutung gewinnen. Zwei Gründe, die dafür sprächen sind: 1. Solche Systeme sind leicht aus kommerziellen Modulen zusammen zu stellen, die Steuerung kann jede übliche Software übernehmen, die Vielfalt der angebotenen Trennmedien (Säulen, Kapillaren) ermöglicht nahezu jede denkbare Kombination. 2. Die Komplexität der Proben und damit die Notwendigkeit, die chromatographische Auflösung zu erhöhen, nimmt zu.
Der chromatographische Trennprozess als solcher rückt wieder in den Mittelpunkt. Man denkt etwas gründlicher und überlegter über „einfache“ Optimierungstools wie Lösungsmittel, Homogenität/Heterogenität der Oberfläche der stationären Phase, Temperatur usw. nach.
Die Monolithen haben sich etabliert, deren Zukunft dürfte jedoch eher in dem Medium „Kapillare“ bzw. im präparativen Maßstab denn in klassischen Säulen zu finden sein. Offensichtlich lassen sich die Anwender nur schwer von Monolithen für „normale“ Trennung begeistern.
Das „um die Ecke denken“, die „warum eigentlich so und nicht anders herum“-Haltung und das Hinterfragen von Bestehendem wird immer häufiger angetroffen, es wird zur Normalität – eine äußerst erfreuliche Entwicklung.
Chemometrie, generische Algorithmen, Optimierungstools etc. werden als Werkzeuge immer mehr eingesetzt: Man möchte lieber rechnen, um Vorhersagen zu treffen, Zusammenhänge klarer erkennen und ökonomischer Methodenentwicklung betreiben. Das Denken und das Rechnen wird dem „fleißigen (und teueren) Messen“ vorgezogen.
Kein HPLC-Symposium ohne neue stationäre Phasen: Die modernen RP-Phasen haben einen polaren Charakter, einige davon sind/sollen alkali-stabil sein und alle sind natürlich mit Abstand besser als die gesamte Konkurrenz…Chirale stationäre Phasen werden nun in Kapillaren, bereits als 3 µm-Material und mit Monolithen als Matrix angeboten, chirale Trennungen werden immer wichtiger.
PAT (Prozess Analytical Technology), DIS (Data Information Systems) DAM (Data Analysis and Management) usw. sind Begriffe, die in nächster Zukunft uns vermutlich begleiten werden. Der Ansatz ist sicherlich sinnvoll. Es gilt abzuwarten, wie die Umsetzung in der Praxis gelingt.

2006 findet dieses Symposium in San Francisco, USA, 2007 in Ghent, Belgium, statt.

Stavros Kromidas, Saarbrücken