„HPLC2009“ – Trends in der HPLC

Vom 29. Juni bis 2. Juli 2009 fand in Dresden die „HPLC2009“, das „34. International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques“ statt. Dieses Symposium ist das mit Abstand wichtigste auf dem Gebiet der HPLC und verwandter Techniken. Dr. Stavros Kromidas gibt im nachfolgenden Beitrag einige Eindrücke wieder und zeigt Schwerpunkte und Trends auf.

2-3 Worte zu Beginn…

Klischees existieren, um widerlegt oder bestätigt zu werden. So sagt man es den Deutschen nach – Prof. Dr. Christian Huber, der Chairman des Symposiums, und Prof. Dr. Wolfgang Lindner möchten mir nachsehen, dass ich mich hier auf den Veranstaltungsort beziehe, der Anteil der österreichischen Kollegen am Gelingen dieser Tagung ist nicht groß genug zu würdigen - sie seien Weltmeister in der Organisation, ferner eher zurückhaltend und Freunde der leisen Töne, Qualität und Zuverlässigkeit stünden an erster Stelle. Das stimmt – jedenfalls bei der „HPLC2009“: Es wird schwierig werden, eine derart perfekte Organisation zu überbieten, alles lief ruhig und so, wie es sein sollte: Nichts wurde dem Zufall überlassen, es gab keine Pannen, keine Verzögerungen, keine übertriebene Selbstdarstellung usw..

Man sagt den Deutschen weiterhin nach, sie seien eher spröde. Wenn sie gut essen wollen, gingen sie lieber zum Italiener, Griechen oder Inder, sie hätten außer für die „Sache“ kein Auge für das Geschehen links und rechts, Charme sei eine Tugend anderer Ethnien. Das stimmt nicht – jedenfalls bei der „HPLC2009“: Die über 50 Helferinnen und Helfer (DoktorandInnen aus Österreich und Deutschland sowie Mitarbeiter der GdCh) waren nicht nur „überall“ und stets hilfsbereit, sondern sehr freundlich – mitunter auch humorvoll – die Bewirtung und speziell das Essen waren mehr als hervorragend. Nachfolgend nur ein einziges Beispiel außerhalb des wissenschaftlichen Rahmens, das nach meiner Ansicht Erwähnung verdient: Als letzten Akt des Symposiums bat Prof. Dr. Huber – mit einem „HPLC2009“-T-Shirt bekleidet - alle HelferInnen nach vorne, jene wurden vom Organisationskomitee und dem Plenum sehr herzlich bedankt, jede(r) erhielt zum Abschied eine Blume. Eine derart nette, sympathische Geste habe ich bis dato bei keinem der vorherigen Symposien erlebt.

…und nun ein paar Zahlen

Man zählte insgesamt etwas über 1.200 teilnehmende Personen, es wurden ca. 130 Vorträge und Tutorien, ferner 16 Firmenseminare abgehalten, die Anzahl der Poster betrug ca. 640 und an der Ausstellung beteiligten sich knapp 65 Firmen. Diese Zahlen sind um ca. 10% niedriger als bei der letzten Tagung auf europäischem Boden in Belgien. Die größte Teilnehmergruppe mit 455 Teilnehmern kam erwartungsgemäß aus Deutschland gefolgt von den USA (124 Teilnehmer). Recht stark vertreten mit je ca. 50-70 Teilnehmer waren Großbritannien, Schweiz, Frankreich, Ungarn und die Niederlanden, aus dem asiatischen Raum kamen ca. 70 Wissenschaftler. Wenn man nun von der Gesamtzahl der Teilnehmer Vortragende, Poster-Autoren und Firmenvertreter abzieht, waren ca. 400-450 „reine“ Besucher zugegen, was in der aktuellen Situation ein sehr gutes Ergebnis darstellt. Schließlich wurden am mittwöchentlichen Dinner 239 L Bier konsumiert. Die Zahl der dort Anwesenden vergessen wir lieber, sonst könnten Sie ja den durchschnittlichen Verbrauch ausrechnen… Kommen wir jetzt zum wissenschaftlichen Teil: Ich werde versuchen - aus einer sicherlich subjektiven Sicht - die wichtigsten Neuigkeiten bzgl. Säulen, Techniken, Interessensgebieten und Instrumenten darzustellen.

Instrumente, Allgemeines

In der Zwischenzeit findet man kaum einen großen Geräte-Hersteller, der kein Instrument anbietet, das Trennungen bei 1.000 oder gar 1.200 bzw. 1.500 bar ermöglicht. Die Lebenscyclen der Geräte werden schwindelerregend kürzer, ein Beispiel dazu: Bei manch einem Anwender entstand schon ein komisches Gefühl, falls er gerade vor einem Jahr eine 1.200er Anlage von Agilent erstanden hatte und ein Jahr später bei der Präsentation des 1.290er-Gerätes von Agilent die tatsächlichen oder vermeintlichen Vorteile dieses Gerätes gegenüber denen der Konkurrenz vorgestellt bekam - inkl. der eigenen 1.200er-Maschine …
In diesem Zusammenhang wundern Sprachkonstrukte wie „next generation“ (wir aber haben es schon heute), „new innovation“ (die Konkurrenz verwendet offensichtlich „old“ (!) „innovation“), „the real (…) fastest instrument worldwide“, „world´s highest sensitivity“ usw. nicht mehr. Wenn man nicht über diese ganzen „ultra“ und „best“ Säulen und Geräte verfügt, fragt man sich so langsam, wieso man selbst überhaupt mit „traditional“ Produkten dennoch halbwegs vernünftige Ergebnisse bekommt…

Man kann dieser Entwicklung sicherlich auch etwas Positives abgewinnen: Der enorme Verkaufsdruck unter den Anbietern führt dazu, dass die Evolution der Geräte zu permanenten, aus Anwendersicht sehr interessanten technischen Verbesserungen führt: Geringste Verweilvolumina bei Gradienten (z.B. ca. 35 µL), inerte Materialien im Autosampler, um Memoryeffekte auf ein Minimum zu reduzieren, inerte Druckaufnehmer, Drucksensoren für den Betrieb der Pumpe, um ohne Kompressionen und Verzögerungen Flussstabilität in einem großen Fluss-/Druckbereich zu ermöglichen, neues Zellen-Design mit kleinsten Volumina, jede Menge „Add-on´s“ in der Auswertesoftware usw..
Die Hersteller haben darüber hinaus erkannt, dass neben der - aus ihrer Sicht hoffentlich großen Anzahl an noch zu verkaufenden - U(H)PLC-Gerätendie klassischen HPLC-Geräte noch viele Jahre parallel existieren werden. Also versucht man mit Hilfe diverser Plattformen (Software- und Hardwaretools) den Transfer von HPLC- zu U(H)PLC-Methoden und vice versa möglichst leicht zu machen; den Anwendern soll ein hohes Maß an Flexibilität, Produktivität und leichtem Handling von großen Datenmengen ermöglicht werden.
Dazu stellvertretend einige Beispiele: Geräte, die HPLC-, U(H)PLC- und auch semipräparative Trennungen ermöglichen, oder die Möglichkeit anbieten, dass während an einer Säule getrennt, eine zweite Säule gespült wird (Agilent), parallel geführte Trennungen, flexibles Arbeiten durch Einsatz z. B. von zwei Gradientenpumpen in einem Gehäuse untergebracht, automatisches Datenhandling von knapp 500 Chromatogrammen (Dionex), LC x LC Trennungen (Shimadzu).
Auch wird mittlerweile – gezwungen durch die Erfahrungen der Anwender - offen über die Schwierigkeiten bzw. über die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen gesprochen, wenn man die U(H)PLC-Geräte tatsächlich als solche nutzen möchte und sie nicht lediglich als klassische Geräte für schnelle Trennungen „missbraucht“: Nicht „Gradient grade“ sondern „U(H)PLC-grade“ Qualität von Lösungsmitteln und Chemikalien und Filtration über = 0,2 µm Filter ist notwendig. Man macht sich öffentlich Gedanken über die Problematik von Temperaturgradienten in der Säule im Falle von Drücken oberhalb ca. 800 bar usw..
Nahezu alle Geräte-Hersteller versuchen mit Hilfe von Van Deemter oder Poppe-/kinetic-Plots die Vorteile der kleinen bzw. der fused core-Teilchenzu belegen. Dabei geht es zum Einen um die Möglichkeit von schnellen Trennungen – dafür stellen solche Auftragungen ein geeignetes/richtiges Tool bzw. Argumentation dar – und zum Anderen um die Verbesserung der Auflösung – und dies wiederum ist nur bedingt richtig: Erstens nimmt die Auflösung nicht linear sondern nur mit der Wurzel der Bodenzahl zu und zweitens werden bei den gezeigten Beispielen kleine, unproblematische Moleküle verwendet. Sobald etwas größere Moleküle, viskose Eluenten und zusätzliche (polare) Wechselwirkungen im Spiel sind, schwindet der Vorteil der kleinen Teilchen: Die langsame Kinetik „beschert“ dem System leider einen großen C-Term in der Van-Deemter-Gleichung, die Auflösung wird trotz kleinen Teilchen nur marginal besser.
Einige Firmen verwiesen in ihren Firmen-Seminaren richtigerweise auf die wesentlich wichtigere Rolle der Selektivität („Chemie“, Wechselwirkungen) - auf die Auflösung. Man freute sich zunächst, aber der weitere Verlauf der Präsentation war stets eine Enttäuschung: Diesem kurzen, richtigen Hinweis jagte wie aus einer Pistole ein Beispiel das nächste, diese unzähligen Beispiele sollten „beweisen“, wie einmalig die eigene(n) Säule(n) ist/sind. Schade.

Säulen

Die Matrix

Kleinere Teilchen als 1,5-1,7 µm wird es auf breiter Front wohl vorerst nicht geben, somit wendet man sich eher der Stabilität der sub2 µm-Teilchen sowie einer möglichst geringen Korngrößenverteilung zu. Ansonsten gilt die Aufmerksamkeit verstärkt der „fused core“ Technologie. Das erinnert mich ein bisschen an die UPLC-Einführung: Als Acquity 2004 von Waters eingeführt wurde, wurde sie vorerst von der Konkurrenz als nicht robust, nicht notwendig, nicht wirklich neu usw. apostrophiert, zwei Jahre später erschienen auf dem Markt die ersten ähnliche Geräte von just jener Konkurrenz. So wurde HALO vor zwei bis drei Jahren als neu entdeckter alter „Hut“ aus den 60er Jahren bezeichnet (was nicht ganz verkehrt ist…), aber es ist aufgrund der positiven Erfahrungen damit zu rechnen, dass in spätestens zwei bis drei Jahren kaum ein größerer Säulenhersteller kein „fused core“ (oder: „superficial“, „poroshell“) Material anbieten wird. Schließlich sei erwähnt, dass die Monolithen nach wie vor im Vordergrund stehen, wenn es um die Bewältigung von Druckproblemen geht: Serielle Säulenkopplung, lange Kapillaren.

Die Chemie

Der Trend der letzten Jahre hält an: Die „Chemie“ in der Chromatographie erlebt eine Renaissance, es werden immer wieder neue stationäre Phasen sowie bekannte Materialien mit zusätzlichen Funktionalitäten wie CN, Amid, Phenyl usw. vorgestellt. Der unangefochtene „Star“ z. Zt. ist und bleibt HILIC: Jeder größere Säulenanbieter erweitert sein Repertoire an HILIC-Materialien: Von Kieselgel (klassisch bis vernetzt) bis hin zu diversen polaren Phasen. Die Vielzahl an angebotenen HILIC-Materialien ist bereits bemerkenswert – und sie wird zunehmen.

Techniken, Themen, Interessensgebiete

Um ein Gefühl zu bekommen, welche Interessen die forschende HPLC-Gemeinschaft verfolgt, ist es fast besser, sich die Themen der Poster, denn der Vorträge und Tutorien anzuschauen. Letztere geben zweifelsohne auch ein sehr gutes Bild von „what´s on“ in der HPLC aber die Auswahl erfolgt dort auch nach anderen Kriterien. Ich habe mir die Mühe und eine kleine Statistik bzgl. der Poster gemacht (zur Erinnerung: 640 Poster), hier ein kurzer Bericht:

Ca. 110 Poster hatten als Thema „Fundamentals of LC-Separations“ und „Advances in LC Methologies“, aber es gab nur knapp 40 Poster zu allen übrigen Techniken: CE, CEC, „Electroseparations“, „Chip Technology“ und SFC. Die Anzahl der Poster zum Thema LC-Kopplung mit MS und NMR war mit 18 genauso groß wie für „Multidimensional Separations“, ein Beleg dafür, dass offensichtlich der chromatographischen Auflösung mindestens soviel Aufmerksamkeit geschenkt wird wie der Bemühung um eine spezifische Aussage mittels Spektroskopie. Das Thema „Stationary Phase Innovations“ mit 50 Postern beweist, wie viel mit der Oberfläche von Kieselgel – und in untergeordneter Rolle von anderen Matrices – immer noch anzufangen ist… Dass die „Life Sciences“ inkl. „Pharma“, „Bio“ und „Clinical“ mit über 200 Postern seit Jahren die Champions-Rolle inne haben, sei nur der Vollständigkeit halber genannt. Dank den neuen Techniken (LC-MS-Kopplung, Miniaturisierung, LC x LC-Trennungen) erfahren die Themen „Environmental Analysis“ mit 53 und „Food and Beverage Analysis“ mit 62 Postern ebenfalls eine Renaissance. Restliche Themen wie „Industrial Aspects of Separations“ oder „Information Management“ waren relativ schwach vertreten. Noch ein letzter Hinweis: Wenn ich mich nicht täusche, war es in Dresden das erste Mal, dass sich „Natural Medicine Analysis“ mit immerhin 9 Postern als eigenständiger Bereich präsentiert hat.

Es folgen - dem Umfang in den Vorträgen, Tutorien und Postern entsprechend - kurze Kommentare zu den Themengebieten und den Techniken.

CE/CEC

CE/CEC bleibt stabil, was Anwenderzahl und Interesse betrifft, die große Euphorie der späten 1980er und der 1990er Jahre scheint verflossen. Da sich von den großen Anbietern de facto nur Agilent halbwegs ernsthaft mit dieser Technik beschäftigt, wird sie kaum „gepusht“. Es gibt recht wenige CE/CEC-Anwender in den klassischen analytischen Laboren, wesentlich stärkeres Interesse erfreut sich CE/CEC bei Biologen, klinischen Chemikern, Medizinern sowie in der Grundlagenforschung in Form von Chips.

Kopplungstechniken

Das gleiche gilt für die Kopplungstechniken: LC-MS ist nicht mehr neu und aufregend, dafür hat sie sich zu sehr etabliert: In den Vorträgen spielen DAD und andere Detektoren mittlerweile eine untergeordnete Rolle, MS (natürlich auch MSn) hat sich ob der Informationsdichte als die Nummer 1 unter den Detektoren in den Forschungsgruppen avanciert. Ähnlich sieht die Sache bei der LC-NMR-Kopplung aus: Bei jedem Symposium gibt es von Prof. Dr. Klaus Albert einen stets sehr interessanten Vortrag über neue Anwendungen und Erkenntnisse – aber eben keinen von Anwendern. Entweder lieben die NMR-Spektroskopiker die HPLC nicht so sehr oder die Ergebnisse sind so „top secret“, dass darüber nicht berichtet wird.

Miniaturisierung (Microfluidics, Chip-LC, Nanotechnologie)

Was die Säule betrifft, arbeitet man an der forschenden Front mit etwa folgenden Dimensionen: 20-30 mm, 2,1 mm, 1,5-1,9 µm. Die Kapillaren werden immer länger und dünner, hier werden verständlicherweise Monolithen erfolgreich eingesetzt. Es sei auch folgendes erwähnt: Die Chip-Technologie entwickelt sich mit Schnecken-Tempo. Ich kann kaum einen signifikant neuen Entwicklungsschub feststellen, die µ-TAS-Systeme sehen nicht wesentlich anders aus als jene von Michael Widmer und Andreas Manz Ende der 1980er Jahre vorgestellten – wenn man von ein paar wenigen Angström in den Kanälen und ein paar Millisekunden in der Trennzeit absieht… Vielleicht noch eine Einschätzung, an „real life“-Anwender adressiert: Selbstverständlich wird die klassische HPLC noch für viele Jahre existieren. An der Miniaturisierung geht jedoch kein Weg vorbei. Bald wird man kaum ein neues HPLC-Gerät für analytische Zwecke kaufen können, das nicht schnelle Trennungen mit kurzen/dünnen Säulen und kleinen Teilchen erlaubt. Eine – wenigstens mentale – Beschäftigung mit dem Thema wäre sicherlich angebracht.

2D-Chromatographie

2D-Trennungen und hier speziell LC x LC wird in Fällen von komplexer Matrix und/oder sehr vielen Komponenten immer wichtiger. Der Stand der Technik liegt heute in etwa bei 5.000 identifizierten – nicht lediglich getrennten! – Substanzen. Ein chinesischer Referent mit seinem 20(!)-köpfigen Team hat das nächste Ziel genannt: 50.000 Substanzen trennen und identifizieren. Nach den gezeigten Ergebnissen bin ich persönlich irgendwie schon bereit, ihm das abzunehmen… Folgende Info unkommentiert: Obwohl diejenigen Firmen, die die Hardware für solche Trennungen anbieten, ihre Zentrale oder wenigstens eine große Niederlassung in Deutschland haben (Dionex, Shimadzu, Waters), gab es zu dieser zukunftsträchtigen Technologie für sehr komplexe Gemische/Matrices keinen einzigen Vortrag aus Deutschland.

Ich denke, Folgendes sollte noch erwähnt werden: Neben den diversen, fachlich orientierten „Sessions“ wurde die Tradition der Symposien-Reihe weitergeführt, mindestens eine „Session“ mit einem übergeordneten Thema anzubieten. Ich möchte auf die „Session“ „Quality by Design“ hinweisen. Vertreter der FDA und der europäischen EDQM haben wiederholt und glaubwürdig die Zusammenarbeit mit der Industrie angemahnt, die Rede war immer wieder von „Quality“ und „Robustness“ von Prozessen und Methoden und die apellartigen Hinweise, man möge sich doch verstärkt um Verbesserung der Analytik und damit um gesicherte(re) Aussagen kümmern, statt im Nachhinein „Qualität“ zu kontrollieren.

Zusammenfassung

Die Miniaturisierung (Säulendimensionen, Partikelgröße) wird immer wichtiger, die Hersteller liefern bereits heute überzeugende und weitgehendst ausgereifte Lösungen. Die Evolution der Geräte wird jedoch noch einige Jahre andauern. Mehrdimensionale Chromatographie gekoppelt mit MS wird für komplexe Proben immer wichtiger. HILIC, „fused core“ an erster Stelle sowie sub2 µm-Teilchen und Monolithen an zweiter Stelle beherrschen die Szene der Füllmaterialien. µTAS und weitere Techniken auf Chip-Basis sind und bleiben vorerst im Wesentlichen eher ein Forschungsgebiet, ebenso wie CE und CE-MS/CEC.
Die nächsten Tagungen finden 2010 in Boston und 2011 in Budapest statt.

Stavros Kromidas, Saarbrücken